在人源化小鼠中进行免疫肿瘤学建模

通过设计得到的免疫缺陷小鼠缺乏适应性免疫，这使其成为支持人类肿瘤细胞移植和生长的理想宿主。由于缺乏功能性免疫细胞，利用免疫缺陷小鼠的临床前异种移植模型仅限于免疫疗法的研究。本聚焦文章将重点介绍一种方法，其中人T淋巴细胞可以在免疫功能低下的小鼠中繁殖并支持肿瘤异种移植物的生长。

植入了人类外周血单核细胞（hPBMC）的NOD-scid IL2Rγnull (NSG)小鼠已被用于异种移植模型，并成功评估了靶向人T淋巴细胞表位的免疫检查点抑制剂的功效和药效学1。该模型相对于常规异种移植物是独特的，因为功能性人类T细胞可以靶向小鼠肿瘤上的人类表位，具有可直接转化的临床意义。NSG小鼠缺乏树突状细胞和巨噬细胞，并带有两个特定的突变，使它们的淋巴细胞高度缺乏。Pkrdc突变会导致DNA修复功能失效，从而导致小鼠B细胞和T细胞缺陷，并且IL2Rγ的缺失会阻止NK细胞成熟2。结合以上各种缺陷，得以实现hPBMC的植入以及NSG小鼠中人类T淋巴细胞的扩增。

在选择人类供体和肿瘤模型之前，必须对植入hPBMC的NSG小鼠一些值得注意的因素进行评估。首先，将人类免疫细胞施用于小鼠会导致T细胞介导的毒性与移植物抗宿主病（GvHD）一致，其中人类淋巴细胞攻击小鼠组织，从而限制了治疗区间3。其次，已经观察到移植效率、存在的细胞类型和活性在人类供体来源之间是可变的4。最后，我们观察到了hPBMC排斥人肿瘤异种移植物的情况（数据未显示）。在开始最终疗效研究之前，用选择的供体来源和肿瘤模型评估这些参数对于转化早期研发项目的成功至关重要。

实验设计

这项研究的目的是评估从hPBMCs向携带皮下人类肿瘤异种移植物的NSG小鼠植入人类T淋巴细胞。在AAALAC认可的研究中心，按照《实验动物饲养管理和使用指南》进行动物饲养管理和使用。皮下植入MiaPaCa-2人胰腺导管腺癌的NSG小鼠（Jackson Laboratories，美国缅因州巴港，品系#0005557）静脉注射来自四个不同正常健康供体的hPBMC（Hemacare，美国加州洛杉矶）。进行了肿瘤生长、体重和GvHD样特征评估。在注射hPBMC后的第14、28和42天，收集全血用于人类淋巴细胞标记物的流式细胞术分析，以确认供体植入CD45+细胞，包括CD4+和CD8+细胞（图1）。

图1 - 评估MiaPaca-2荷瘤NSG小鼠hPBMC植入的实验设计。

肿瘤生长、体重和疾病进展

未经治疗的对照组动物的MiaPaCa-2肿瘤倍增时间（Td）为9.1天，给予hPBMC的动物的Td范围为8.7至11.6天。植入30天后，在给予hPBMC的个体中观察到生长变化。1000mm³之前的肿瘤生长不受hPBMC植入的影响（图2）。这些结果表明，所利用的任何供体都适合进行MiaPaCa2功效研究，达到评估尺寸的时间（TES）为1000mm³。

图2 - 给予hPBMC后MiaPaCa2皮下肿瘤（n=10）的肿瘤生长。

通过体重和临床观察监测GvHD症状的发作。尽管在本研究中未在病理学上得到证实，但在该模型中观察到的症状与疾病密切相关5。症状包括超过基线10%的体重减轻（图3）、粗骨结、弓背、皮肤损伤和腹泻——表现出所有症状或严重程度高的动物均已从研究中排除。注射hPBMC三十二天后，每组有一半或以上的动物观察到临床体征。GvHD症状未消除的动物由于肿瘤负担超过2000mm³或研究终止而被排除。

图3 - 注射hPBMC后的体重变化评估

人淋巴细胞的植入和持久性

在注射hPBMC后14、28和42天，通过对来自NSG小鼠外周血的人类免疫细胞标记物的免疫表型分析对移植物进行测量：mCD45（鼠泛白细胞）、hCD45（人泛白细胞）、hCD3（泛T细胞）、hCD4（T辅助细胞和T-reg ）和hCD8（细胞毒性淋巴细胞）通过流式细胞仪检测（图4）。

通过体重和临床观察监测GvHD症状的发作。尽管在本研究中未在病理学上得到证实，但在该模型中观察到的症状与疾病密切相关5。症状包括超过基线10%的体重减轻（图3）、粗骨结、弓背、皮肤损伤和腹泻——表现出所有症状或严重程度高的动物均已从研究中排除。注射hPBMC三十二天后，每组有一半或以上的动物观察到临床体征。GvHD症状未消除的动物由于肿瘤负担超过2000mm³或研究终止而被排除。

图4 - 在用hPBMC重构的NSG小鼠中检测人类免疫细胞的设门策略实例。

hCD45+百分比按照活细胞总数（基于绝对细胞计数/ µL全血）中hCD45+细胞的百分比计算，并用作hPBMC植入程度的指标。我们发现，随着时间的推移，在所有供体中都检测到了全血中的%hCD45+细胞（图5）。然而，与供体1和3相比，供体2和4在个体基础上表现出更大的hCD45细胞增幅，前者的置入率在注射hPBMC后第42天前的水平较低。注射hPBMC后28天，所有组的动物均达到%hCD45植入水平，这与有关模型的已发表文献一致⁶.

向NSG小鼠注射hPBMC可导致人类T细胞在小鼠中持续存在，而对MiaPaCa-2肿瘤生长的影响最小。该模型代表了一个强大的临床前平台，该平台可以审视利用人类T淋巴细胞指导直接抗肿瘤活性的新型药物的作用，并具有直接的临床意义。未来的研究将证明FDA批准的免疫疗法针对hPBMC重构的NSG小鼠中人肿瘤异种移植物的功效。

图5 - 从注射hPBMC的NSG小鼠的全血中检测到的hCD45+细胞的植入水平

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参考资料