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酶诱导

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FDA和EMA推荐的研究

细胞毒性和稳定性测定

CYP mRNA和酶诱导

研究药物的代谢特质时,建议将酶诱导研究纳入其中,以突出潜在的问题,即当药物诱导或增强酶表达时,达到同时给药的有效血浆浓度。酶诱导可导致代谢清除率增加或由活性代谢产物全身暴露增加引起的毒性。

CYP酶(通常为CYP1A2, CYP2B6和CYP3A4的诱导)是在人肝细胞单层培养物中暴露于受试品后在体外测量的。

初始实验应研究诱导CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4酶的潜力。如果观察到CYP3A4酶的诱导,申办方还应评估CYP2C酶(CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19)的诱导潜力。然后将其作用与所研究的CYP酶的阳性对照诱导剂所引起的作用进行比较。此外,在安全性评估研究中进行体内给药后,可以将离体动物肝脏(通常是小鼠、大鼠、狗或猴子)加工成亚细胞组分,并用于评估受试品介导的对药物代谢酶的作用。

酶诱导研究的监管注意事项

FDA和EMA药物间相互作用(DDI)准则均建议先开展这些研究以评估CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4的细胞色素P450诱导,然后再进行首次应用于人体的试验

诱导数据用于确定临床DDI研究的要求和范围。

方法

  • 测试系统:冷冻保存的个人人类供体肝细胞
  • 接受评估的CYP酶:CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4/5。
  • 受试品浓度:选择以预测临床暴露(0.1 - 10X Cmax),除非受溶解度限制。选择5种浓度用于细胞毒性研究,选择7种浓度用于mRNA诱导研究,选择3种浓度用于酶活性研究。
  • 培养时间:72小时,每24小时更换一次培养基。

细胞毒性

在初步分析中,将来自一个供体的肝细胞在加湿的培养箱中,在37°C温度、5% CO2条件下,在存在受试品(5种浓度)或阳性对照他莫昔芬(50 µM)的培养孔(一式三份)中培养72小时,每隔24小时更换一次培养基±受试品或对照物。72小时后,将使用MTS测定法评估肝细胞的活力。结果将用于确定诱导检测方法的无毒受试品浓度。

稳定性

结合细胞毒性测定,采集培养基样本以评估随时间变化的受试品浓度。

CYP mRNA诱导

将来自三个供体的肝细胞在加湿的培养箱中,在37°C温度、5% CO2条件下,在存在或不存在受试品(七种浓度)或对照诱导剂(见下文)的培养孔(一式三份)中培养72小时,每隔24小时更换一次培养基±受试品或对照物。72小时后,提取mRNA,并通过实时定量PCR确定基因表达。将每个CYP mRNA的水平相对于内源性对照基因(例如GAPDH)的水平进行标准化。然后使用2-ΔΔCT方法计算CYP基因表达的诱导倍数。相对于空白对照受试品依赖性CYP mRNA水平增加≥2倍,或阳性对照反应的应答≥20%可解释为阳性结果。

CYP酶诱导

将来自三个供体的肝细胞在加湿的培养箱中,在37°C温度、5% CO2条件下,在存在或不存在受试品(三种浓度)或对照诱导剂(如上所述)的培养孔(一式三份)中培养72小时,每隔24小时更换一次培养基±受试品或对照物。72小时后,将肝细胞在含有适当CYP底物(见下文)的新鲜培养基中培养2小时,此后终止反应,并收集样本,采用液相色谱-质谱联用法(LC-MS)进行代谢产物分析(见下文)。相对于空白对照受试品依赖性CYP酶活性增加≥2倍,或阳性对照反应的应答≥20%可解释为阳性结果。

 

 

 

酶活性测定

CYP酶

诱导剂

非诱导剂

底物

分析物

CYP1A2

奥美拉唑

氟马西尼

非那西丁

乙酰氨基酚

CYP2B6

苯巴比妥

氟马西尼

安非他酮

羟基安非他酮

CYP3A4/5

利福平

氟马西尼

咪达唑仑

1'-羟基咪达唑仑

交付成果

这些检测方法将确定与已知的CYP酶诱导剂相比的mRNA和酶活性水平。如果适用,也将确定EC50和Emax

在评估临床试验需求时, 如果观察到阳性结果,则定量药理学或能提供其他指导。

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