酶诱导

• 测试系统：冷冻保存的个人人类供体肝细胞
• 接受评估的CYP酶：CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4/5。
• 受试品浓度：选择以预测临床暴露（0.1 - 10X C_max），除非受溶解度限制。选择5种浓度用于细胞毒性研究，选择7种浓度用于mRNA诱导研究，选择3种浓度用于酶活性研究。
• 培养时间：72小时，每24小时更换一次培养基。

细胞毒性

在初步分析中，将来自一个供体的肝细胞在加湿的培养箱中，在37°C温度、5% CO2条件下，在存在受试品（5种浓度）或阳性对照他莫昔芬（50 µM）的培养孔（一式三份）中培养72小时，每隔24小时更换一次培养基±受试品或对照物。72小时后，将使用MTS测定法评估肝细胞的活力。结果将用于确定诱导检测方法的无毒受试品浓度。

稳定性

结合细胞毒性测定，采集培养基样本以评估随时间变化的受试品浓度。

CYP mRNA诱导

将来自三个供体的肝细胞在加湿的培养箱中，在37°C温度、5% CO2条件下，在存在或不存在受试品（七种浓度）或对照诱导剂（见下文）的培养孔（一式三份）中培养72小时，每隔24小时更换一次培养基±受试品或对照物。72小时后，提取mRNA，并通过实时定量PCR确定基因表达。将每个CYP mRNA的水平相对于内源性对照基因（例如GAPDH）的水平进行标准化。然后使用2-ΔΔCT方法计算CYP基因表达的诱导倍数。相对于空白对照受试品依赖性CYP mRNA水平增加≥2倍，或阳性对照反应的应答≥20%可解释为阳性结果。

CYP酶诱导

将来自三个供体的肝细胞在加湿的培养箱中，在37°C温度、5% CO2条件下，在存在或不存在受试品（三种浓度）或对照诱导剂（如上所述）的培养孔（一式三份）中培养72小时，每隔24小时更换一次培养基±受试品或对照物。72小时后，将肝细胞在含有适当CYP底物（见下文）的新鲜培养基中培养2小时，此后终止反应，并收集样本，采用液相色谱-质谱联用法（LC-MS）进行代谢产物分析（见下文）。相对于空白对照受试品依赖性CYP酶活性增加≥2倍，或阳性对照反应的应答≥20%可解释为阳性结果。