当药物进入并出现在体循环中之后,只有游离部分和未结合部分才能产生药理(或毒理)效应。血浆蛋白结合程度可通过平衡透析、超滤或超速离心法进行体内或体外测定。
在动物和人类血液中,可以在体内或体外测定供试品的红细胞和血浆分隔情况。可采用平衡透析进行微粒体蛋白结合评估。为帮助对药理学、药代动力学和毒理学数据进行评估,需要描述药物如何与血浆蛋白结合以及血液-血浆分隔如何发挥作用的数据。(另见SEND 3.1)
监管合规
多元化方法
疗效与安全性分析
当药物进入并出现在体循环中之后,只有游离部分和未结合部分才能产生药理(或毒理)效应。血浆蛋白结合程度可通过平衡透析、超滤或超速离心法进行体内或体外测定。
在动物和人类血液中,可以在体内或体外测定供试品的红细胞和血浆分隔情况。可采用平衡透析进行微粒体蛋白结合评估。为帮助对药理学、药代动力学和毒理学数据进行评估,需要描述药物如何与血浆蛋白结合以及血液-血浆分隔如何发挥作用的数据。(另见SEND 3.1)
研究供试品的血浆或微粒体蛋白未结合部分对于描述临床药理学中剂量、风险、功效和安全边际的体内药代动力学特征至关重要。血浆蛋白结合的跨物种评估是一项临床研究申请(IND)要求,并在ICH M3(R2)指南中进行了详细说明。
采用高通量透析仪(HTDialysis LLC、Gales Ferry、CT)进行平衡透析。向供体腔内添加强化基质(血浆或分离血浆蛋白),同时在接收腔室内添加杜伯科磷酸缓冲盐溶液(DPBS)。然后用透气薄膜密封培养皿,并根据指定时长在37°C的温度下在5%的CO2中进行培养(见下文)。完成培养之后,使用液相色谱-质谱联用法(LC-MS)对来自每个腔室的样品进行分析。
强化血浆将被添加至超滤装置(分子量筛截为30,000 Da)的样品储存部分。样品将在37°C的温度和2,000 × g的条件(或其他适当条件)下进行15分钟的离心分离。完成离心分离之后,将使用LC-MS对供试品及内容的超滤液进行分析,并与初始浓度进行比较。所有的蛋白结合测定将按一式三份进行。
强化血浆将被放入超速离心管中,在37°C的温度和223,000 × g的条件(或其他适当条件)下进行4小时的离心分离,以实现血浆与血浆蛋白的超速分离。完成离心分离之后,将使用LC-MS对超速离心液进行分析,并与初始浓度进行比较。
BPP研究被用于对在不同物种(包括人类)血液中的供试品进行体外血液-血浆分隔测定。
将供试品添加到血液中并进行初始取样。如图所示,强化血液在37°C的温度下进行培养。完成培养之后,移除试样进行分析。剩余的血液通过离心分离获得血浆;收集试样以进行分析并与初始试样进行比较。
对于放射性标记供试品,将在液体闪烁计数(LSC)之前进行血样增溶。对于非放射性标记供试品,将在使用液相色谱-质谱联用法(LC-MS)进行提取和分析之前对血样进行细胞溶解。
供试品与人肝微粒体蛋白结合潜力的体外评估有助于在使用这些系统的检测方法中校正未结合分数。
采用高通量透析仪(HTDialysis LLC、Gales Ferry、CT)进行一式三份的平衡透析。将强化微粒体添加至供体腔室内,同时在接收腔室内添加检测缓冲液。然后用透气薄膜密封培养皿,并在37°C的温度下在5%的CO2中培养5小时。完成培养之后,使用液相色谱-质谱联用法(LC-MS)对来自每个腔室的样品进行分析。
血浆蛋白结合检测方法将确定供试品结合程度,提供结合和未结合百分比、达到透析平衡的时间以及人类和其他选定临床前试验物种的浓度依赖性特征。血液-血浆分隔将会提供一个分配系数。这些数据可用于计算血浆中的游离组分,从而校正体内暴露值以描述功效和安全边际。
微粒体蛋白结合检测方法将确定供试品与人肝微粒体蛋白的结合程度,用于校正游离药物组分说明的IC50或其他参数。
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