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反应表型

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监管合规

综合酶评估

同工型特异性化学抑制剂和重组酶

反应表型研究旨在评估同工型特异性酶抑制剂对于在合并的人肝微粒体中培养的父代供试品消失的影响。采用重组个体药物代谢酶异构体进行培育可证实酶的活性。

对导致供试品产生代谢反应的酶进行评估,以凸显由单一酶或多态表达酶催化的代谢路线等潜在影响。

反应表型研究的监管考虑因素

根据药物相互作用(DDI)指南,建议将CYP酶(CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A)研究作为初始研究,以便更好地了解药物的清除途径。如果这些主要的CYP酶不参与药物的代谢,则应对其他的I期和II期酶进行评估,包括:

  • CYP酶(CYP2A6、CYP2J2、CYP4F2和CYP2E1)
  • 非CYP酶,包括醛氧化酶(AO)、羧酸酯酶(CES)、单胺氧化酶(MAO)、黄素单氧合酶(FMO、黄嘌呤氧化酶(XO)和醇脱氢酶/乙醛脱氢酶(ADH/ALDH)
  • 共轭酶,包括葡萄糖苷酸转移酶(UGT)和磺基转移酶(SULT)

反应表型可提供有关供试品代谢部分的信息,并可用于评估患者DDI潜在影响,为临床研究设计提供信息,预测药代动力学中的个体变异,以及评估基因多态性的影响。

方法

  • 测试系统:合并的人肝微粒体和重组个体表达人体酶及必要的辅因子
  • CYP亚型:CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4。(亦可采用其他的CYP、UGT和药物代谢酶)。
  • 采用同工型特异性化学抑制剂和重组酶进行确认。

供试品使用磷酸缓冲液中的微粒体进行至少5分钟的预培养。通过添加NADPH或其他适当的辅因子启动供试品代谢。通过添加有机溶剂终止培养,然后使用液相色谱-质谱联用法(LC-MS)对供试品和/或其代谢物进行样品分析。

I期 - 优化体外培养条件

在采用NADPH或其他合适辅因子的情况下,供试品一式三份在一定的微粒体浓度范围(通常为0.1 - 1 mg蛋白/mL)内,按最长60分钟的四个时间点进行培养。

在没有辅因子的情况下进行培养控制。产生供试品消失线性率的微粒体浓度培养条件和时间点被用于定义后续实验。

II期 - 供试品代谢动力学分析

在经过优化的条件下,通过使用一式三份至少八种供试品浓度,对培养样品中的供试品消失速率进行监测。采用米切里斯-曼腾曲线拟合方法对数据进行分析,并确定供试品的动力学参数Km和Vmax

III期 - 使用CYP特异性化学抑制剂进行抑制分析

在使用或不使用酶选择性化学抑制剂的情况下,供试品一式三份在合并的人肝微粒体中进行培养,浓度为<Km。在没有抑制剂,仅使用载体溶剂的情况下进行培养控制。

IV期 - 使用重组人体CYP的代谢

供试品一式三份按<Km的浓度采用一系列的重组人体CYP、UGT和其他DME(见上文)进行培养。在0分钟和60分钟时对供试品的相对浓度进行测定。

交付成果

这些检测方法将确定导致供试品体外代谢的酶及其代谢程度。供试品消失和/或代谢物形成的动力学得以确认。体外代谢评估可确定主要参与其中的酶,并在首次应用于人体试验之前提示体内清除机制的潜在问题。

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