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OECD 229:内分泌干扰物筛查计划 - 鱼类短期繁殖测定法

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内分泌干扰物是一种外源性物质或混合物,可改变内分泌系统的功能,并因此对完整的生物体、其后代或(亚)种群造成不利的健康影响。

作者:

Sarah Broadley,BSc (Hons)、MSc、PGCE、IV级研究科学家,专业病理学服务;Catherine Ross博士,DVM、MSc、MRCVS、病理学家,英国哈罗盖特Covance Laboratories Ltd.病理科

日期:

2021年1月

简介

“内分泌干扰物是一种外源性物质或混合物,可改变内分泌系统的功能,并因此对完整的生物体、其后代或(亚)种群造成不利的健康影响”WHO-ICPS,2002年。

内分泌干扰物筛选计划(EDSP)旨在确定农药、化学品或其他物质是否会因导致内分泌系统干扰而对人类健康或环境构成风险。鱼类短期繁殖测定法(测试准则229)使用黑头呆鱼(肥头鲦鱼)以及日本青鳉和斑马鱼上的端点子集进行验证。该测定法将生殖适合度作为毒物效应的综合衡量标准,使用一套组织学和生化端点,反映与下丘脑-垂体-性腺(HPG)内分泌轴紊乱相关的影响。

法规

2018年,OECD发布了一个经过修订的内分泌干扰化学物检测和评估概念框架。该概念框架包含五个检测级别,其设计目的是作为一个工具箱。

1级 - 基于现有信息的排序和优先级。

2级 - 用于提供机制数据的体外检测方法。

3级 - 用于提供指定内分泌机制和作用相关数据的体内检测方法。

4级 - 用于提供对内分泌机制不良影响相关数据的体内检测方法。

5级 - 用于提供有关内分泌和其他机制影响的全面数据的体内检测方法。

鱼类短期繁殖测定法和两栖动物变态测定法、子宫发育测定法及Hershbergers测定法同属于3级范畴。

目前,欧盟没有针对内分泌干扰物使用特定检测的法律规定(除非有此要求)。

但是,美国存在强制性检测规定,美国环保署(EPA)为此制定了一项两级型策略。

1级检测方法 - 一系列体外和体内检测方法。鱼类短期繁殖测定法和两栖动物变态测定法都在该检测范围内。

2级检测方法 - 包括Mammalian 2代毒性、两栖动物生长/繁殖、Avian 2代、鱼类2代和Mysid 2代在内的体内根尖测定法。

鱼类短期繁殖测定法

材料与方法

测试需要三种测试浓度和对照组。

每次对两个容器内的斑马鱼进行处理(每个容器内包含5条雄鱼和5条雌鱼)。

每次对四个容器内的黑头呆鱼进行处理(鉴于雄性黑头呆鱼的领地行为,每个容器内包含2条雄鱼和4条雌鱼)。

每次对四个容器或重复容器内的日本青鳉进行处理(每个容器内包含3条雄鱼和3条雌鱼)。

对以下参数进行了评估:

分析化学 - 每周从水箱收集水样以分析测试化学品水平。

卵黄蛋白原(Vg)- 采用酶联免疫吸附(ELISA)方法以测定该蛋黄前区蛋白的含量。Vg通常仅在雌鱼体内表达,在雄鱼体内处于休眠状态。然而,当雄鱼暴露于内分泌干扰物中时,Vg基因将以剂量依赖性方式表达。因此,Vg基因在雄鱼体内的表达被用作暴露于雌激素内分泌干扰物的标记。

形态观测 - 第二性征的外观及观察值包括雄性的颜色和脂肪垫(测试终止时的状态和重量)、婚结节映射、每天与对照组相比较的生存率和行为评估。

对受精成功率进行评估,对胚胎进行目视检查,对不育和可育卵子进行计数。

繁殖力 - 评估每日的卵子产量。

生存率、行为和外观 - 在与对照组相比的情况下每天观察鱼的死亡率和异常行为。

第二性征的观察 - 此外还对第二性特化特征进行观察,如雄性黑头呆鱼的婚结节和日本青鳉的乳头状突起。

图1。用于显示雄性黑头呆鱼的婚结节。使用定位模板,对结节的数量和大小进行记录并排序如下:0 - 缺失、1 - 存在、2 - 增大和3 - 显著。

OECD (2012)复制图像,检测编号229:鱼类短期繁殖测定法,OECD化学品检测指南,2部分,OECD Publishing,巴黎。https://doi.org/10.1787/9789264185265-en。

组织学制备

组织修整/处理

黑头呆鱼 - 切除鱼的生殖腺并采用石蜡对整个生殖腺进行处理。

日本青鳉和斑马鱼 - 在必要时修整鱼体,并采用石蜡对整个躯干进行处理。

嵌入 - 生殖腺/鱼按其长轴从水平方向嵌入。

切片法 - 从生殖腺中央进行五个切片步骤,并用苏木精和伊红染色。

组织病理学

雄鱼 - 首要诊断标准包括:睾丸-卵子的精原细胞存在比例增长

睾丸退化增长

间质(莱迪希)细胞增生/肥大

雄鱼 - 次要诊断标准包括:

精原细胞比例减小

加剧血管或间质蛋白液非同步生殖腺发育

精母细胞或精子细胞生殖腺分期的比例变化

肉芽肿性炎症

图1。放大20倍的雄性黑头呆鱼生殖腺。标准为50 µm。


放大40倍的雄性黑头呆鱼生殖腺。

图2。放大40倍的雄性黑头呆鱼生殖腺。标准为20 µm。请注意围绕小叶排列的所有精子发育阶段为:(1) 1˚精原细胞;(2) 2˚精母细胞;(3) 1˚精母细胞;(4) 2˚精母细胞;(5) 精子。

组织病理学

雌鱼 - 首要诊断标准包括:

加剧卵母细胞闭锁

毛囊周细胞增生/肥大减少卵黄形成

生殖腺分期的变化

雌鱼 - 次要诊断标准包括:

间质性纤维化

输卵管内的卵屑肉芽肿性炎症缩减排卵后卵泡

放大4倍的雌性黑头呆鱼生殖腺。

图3。放大4倍的雌性黑头呆鱼生殖腺。标准为200 µm。请注意两图中的卵母细胞发育阶段为:(1) 细胞核周围的卵母细胞;(2) 皮质肺泡卵母细胞;(3) 早期卵黄的卵母细胞;(4) 晚期卵黄的卵母细胞。


放大40倍的雌性黑头呆鱼生殖腺。

图4。放大40倍的雌性黑头呆鱼生殖腺。标准为20 µm。

结果

鱼类短期繁殖测定法是一项筛选试验,旨在提供潜在内分泌活动的迹象,并非用于确认任何特定的机制、作用模式或不利影响。因此,测定法的一个或多个端点上的任何统计方面的显著影响可能表明测试材料对鱼类HPG轴具有潜在干扰性。

参考资料

OECD (2018),关于评估内分泌干扰化学物的标准化试验指南的指导文件150修订版,OECD测试和评估系列,OECD Publishing,巴黎。 https://doi.org/10.1787/9789264304741-en

OECD (2012),检测编号229:鱼类短期繁殖测定法,OECD化学品检测指南,2部分,OECD Publishing,巴黎。https://doi.org/10.1787/9789264185265-en。

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