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OECD 231:内分泌干扰物筛查计划 - 两栖动物变态测定法

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内分泌干扰物是一种外源性物质或混合物,可改变内分泌系统的功能,并因此对完整的生物体、其后代或(亚)种群造成不利的健康影响。

作者:

Sarah Broadley,BSc (Hons)、MSc、PGCE、IV级研究科学家,专业病理学服务;Catherine Ross博士,DVM、MSc、MRCVS、病理学家,英国哈罗盖特Covance Laboratories Ltd.病理科

日期:

2021年1月

简介

“内分泌干扰物是一种外源性物质或混合物,可改变内分泌系统的功能,并因此对完整的生物体、其后代或(亚)种群造成不利的健康影响”WHO-ICPS,2002年。

出于对环境化学品可能对人类和野生动物造成不利影响的担忧,OECD启动了一项高优先级举措,旨在修订和制定用于筛查和检测潜在内分泌干扰物的指导方针。这些检测包括对啮齿类动物的强化型28天重复剂量测试(测试准则407)和两栖动物变态测定法(AMA测试准则231)。

“内分泌干扰物是一种外源性物质或混合物,可改变内分泌系统的功能,并因此对完整的生物体、其后代或(亚)种群造成不利的健康影响”WHO-ICPS,2002年。

出于对环境化学品可能对人类和野生动物造成不利影响的担忧,OECD启动了一项高优先级举措,旨在修订和制定用于筛查和检测潜在内分泌干扰物的指导方针。这些检测包括对啮齿类动物的强化型28天重复剂量测试(测试准则407)和两栖动物变态测定法(AMA测试准则231)。

法规

2018年,OECD发布了一个经过修订的内分泌干扰化学物检测和评估概念框架。该概念框架包含五个检测级别,其设计目的是作为一个工具箱。

1级 - 基于现有信息的排序和优先级。

2级 - 用于提供机制数据的体外检测方法。

3级 - 用于提供指定内分泌机制和作用相关数据的体内检测方法。

4级 - 用于提供对内分泌机制不良影响相关数据的体内检测方法。

5级 - 用于提供有关内分泌和其他机制影响的全面数据的体内检测方法。

两栖动物变态测定法和鱼类短期繁殖测定法、子宫发育测定法及Hershbergers测定法同属于3级范畴

目前,欧盟没有针对内分泌干扰物使用特定检测的法律规定(除非有此要求)。

但是,美国存在强制性检测规定,美国环保署(EPA)为此制定了一项两级型策略。

1级检测方法 - 一系列体外和体内检测方法。两栖动物变态测定法和鱼类短期繁殖测定法都在该检测范围内。

2级检测方法 - 包括Mammalian 2代毒性、两栖动物生长/繁殖、Avian 2代、鱼类2代和Mysid 2代在内的体内根尖测定法。

两栖动物变态测定法

材料与方法

两栖动物变态测定法(AMA)是一种筛查测定法,旨在实证识别可能干扰下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴正常功能的物质。该测定法提供了经过深入研究、依赖于甲状腺的检测过程,对HPT轴内的活性物质做出响应,而且是目前唯一用于对处于形态发育阶段的动物进行甲状腺活动检测的测定法。

检测设计包括让处于阶段51的非洲爪蟾蝌蚪在水分控制环境中在21天内接触至少三种不同浓度的测试化学物质。幼期密度为每个试验罐内20只蝌蚪。

第7天测定情况

五只蝌蚪被随机选择,并通过人道方式致死。对其进行冲洗、拭干并确定体重。确定每只蝌蚪的后肢、吻部到排泄孔的长度和发育阶段。

第21天测定情况

将剩余的蝌蚪移出试验罐,并通过人道方式致死。对其进行冲洗、拭干并确定体重。确定每只蝌蚪的后肢、吻部到排泄孔的长度和发育阶段。

将蝌蚪作为完整样本或经过修整的头部样本(包括下颌)置于戴维森氏固定液(Davidson's fixative)内48至72小时。

对每个试验罐内的五只蝌蚪进行组织病理学评估。

组织学制备

组织修整 - 对整个头部采用石蜡处理。

嵌入 - 头部在水平面上按腹侧到背侧嵌入(纵向(LS)显示)或将切片部位向下嵌入(横向(TS)显示)。

切片法 - 对甲状腺进行五个切片步骤,并用苏木精和伊红染色

组织病理学

诊断标准包括:甲状腺肥大/萎缩 滤泡细胞肥大 滤泡细胞增生

滤泡腔面积/胶体质量和滤泡细胞高度/形状

图1. 甲状腺(箭头),纵切面,2倍放大倍率。


图2. 甲状腺(箭头),10倍放大倍率。标准为50 µm。


图3. 甲状腺(箭头),横切面,2倍放大倍率。


图4. 甲状腺(箭头),横切面,10倍放大倍率。标准为100 µm。

结果

在没有发育影响的情况下,证实了对甲状腺组织学的影响。如果甲状腺出现组织病理学变化,则该化学物质可被视为活性物质。如果未见发育迟滞和组织病理学变化,则该化学物质可被视为甲状腺失活。原因在于甲状腺会受促甲状腺激素(TSH)的影响,任何能够改变循环中的甲状腺激素从而改变TSH分泌的化学物质都会导致甲状腺的组织病理学变化。

参考资料

OECD (2018),关于评估内分泌干扰化学物的标准化试验指南的指导文件150修订版,OECD测试和评估系列,OECD Publishing,巴黎。 https://doi.org/10.1787/9789264304741-en

OECD (2009),检测编号231:两栖动物变态测定法,OECD化学品检测指南,2部分,OECD Publishing,巴黎,https://doi.org/10.1787/9789264076242-en。

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